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Estudo de condições operacionais na produção depenicilina G acilase por diferentes microrganismos.

by Oguri, Renata Tieko

Abstract (Summary)
Penicilina G acilase (PGA) é das enzimas de maior impacto na saúde humana,pois catalisa a desacilação de penicilinas naturais, principalmente a penicilina G, para aobtenção do ácido 6-aminopenicilânico (6-APA), composto chave na produção deantibióticos ?-lactâmicos. Ela é produzida por diferentes microrganismos, dentre osquais Bacillus megaterium, um dos poucos que secreta a enzima. A produção de PGApor esse microrganismo vem sendo estudada há tempos no DEQ-UFSCar. Xanthomonascampestris possui em seu DNA a seqüência genética que codifica PGA e testepreliminar de cultivo de linhagem desse microrganismo doada pelo Departamento deGenética e Evolução da UFSCar mostrou produção extracelular de PGA. Foi iniciado,por isso, meses depois, estudos de produção de PGA por X.campestris, reativando-secultura do microrganismo que estava armazenada no DEQ-UFSCar. Em paralelo, foramobtidas e testadas outras linhagens desse microrganismo, procedentes da Coleção deCulturas Tropical (CCT) e do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR). Cultivosdessas novas linhagens de X. campestris mostraram crescimento celular pequeno, semprodução de PGA. Comparando-se essas novas linhagens com o microrganismo que sevinha trabalhando pode-se verificar então que este não era X. campestris. Omicrorganismo foi a seguir enviado para identificação na Fundação André Toselo. Olaudo dessa Instituição mostrou que o microrganismo que vinha sendo cultivado eraBacillus megaterium de Bary 1884AL (ATCC 35985). Esse resultado já era esperado,pois havia muitas semelhanças entre as duas culturas. Contudo, havia também algumasdiferenças, que motivaram o envio para identificação criteriosa do microrganismoprodutor de PGA. Assim, ao mesmo tempo em que foram realizadas tentativas deadaptação das novas linhagens de X. campestris visando produção de PGA, foraminvestigadas diferentes condições operacionais de produção da enzima com omicrorganismo identificado como B. megaterium, tanto em câmara rotativa ?shaker?como em biorreator, bem como a caracterização da enzima produzida.Ensaios de germinação/propagação de Bacillus megaterium, a 30oC, realizadosem ?shaker?, mostraram que o microrganismo atinge fase estacionária em 24 horas, comvelocidade máxima específica de crescimento µmáx = 0,33h-1. O pH inicial onde seobtém a maior atividade de PGA é 8,0 para o meio de crescimento (propagação) e pH7,0 para o meio de produção. Cultivos a diferentes temperaturas mostraram que 30ºC é atemperatura ótima tanto para o crescimento do microrganismo quanto para produção daenzima. O meio de cultivo composto por aminoácidos consumidos preferencialmentepelo microrganismo - 20 g/L, fenilacetato de potássio - 3,5 g/L, solução com diferentessais ? 0,22 g/L, e soro de queijo-20,0 g/L mostrou ser o mais eficiente na produção daPGA, atingindo máxima concentração celular e atividade enzimática, 4,59 g/L e 592UI/L, respectivamente, em 36 horas de cultivo, com pHs para os meios de crescimento eprodução iguais a 8,0 e 7,0, respectivamente, e temperatura controlada em 30°C.Cultivos do microrganismo em biorreator de 2 L mostraram que a adição denutrientes na forma de pulsos é estratégia eficiente, proporcionando aumento nos níveisde produção da enzima. Estudo da influência de oxigênio dissolvido na produção dePGA mostrou que manutenção de 10% de saturação durante todo o cultivo conduz àmáxima atividade enzimática, 451 UI/L. Essa deve ser realmente a condição ótima paraoxigênio, pois pela primeira vez se obteve maior atividade enzimática no biorreator enão no ensaio em ?shaker?, sempre realizado em paralelo para padronização do estudo. Resultados obtidos na caracterização da enzima confirmaram os valores jáobtidos anteriormente para PGA de B. megaterium: temperatura e pH ótimos foram47°C e 8,0, respectivamente; parâmetros cinéticos obtidos por ajuste do modelo deMichaelis-Menten a dados de velocidades iniciais de hidrólise de penicilina G catalisadapor PGA, a 370C, foram: Vmáx 1,1*10-3 mmol/min*UI e Km 1,51 mM; meia-vida daenzima a 60°C é de 10 minutos, com inativação completa após 45 minutos deexposição. Quanto à estabilidade alcalina, verificou-se a completa desnaturação de PGAapós 90 minutos de incubação a pH 11,0, com tempo de meia vida de 1 minuto.
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Bibliographical Information:

Advisor:Raquel de Lima Camargo Giordano

School:Universidade Federal de São Carlos

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:Engenharia bioquímica Penicilina G acilase - produção ENGENHARIA QUIMICA

ISBN:

Date of Publication:12/20/2006

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