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Estudo das propriedades biofísicas e farmacológicas do poroassociado ao receptors P2X7 e poros de características similares.

by Faria, Robson Xavier

Abstract (Summary)
O receptor P2X7 (EC50= ~100amp;#956;M) induz a permeabilização da membrana celular a moléculas de aproximadamente 900 Da quando ativadas por altas concentrações de ATP quando ativado por altas concentrações de ATP. Até o momento, não conhecemos a correlação entre a abertura docanal catiônico de baixa condutância (8 pS), formado após a estimulação com baixas concentrações de ATP (EC50= ~1 amp;#956;M), e a abertura do poro. Existem pelo menos duas hipótesessobre essa questão: 1) a formação do poro estaria associada a um aumento gradual da permeabilidade (dilatação) dos canais catiônicos; 2) um segundo mensageiro intracelular seriaativado para agir sobre o próprio receptor P2X7, ou agir sobre um canal/ poro diferente. Ainda não sabemos qual é a proteína responsável pela formação desse poro. No entanto, existem descrições da atividade de outros poros com características biofísicas similares ao poro relacionado ao P2X7que poderiam ser o próprio poro P2X7. Nesse sentido, investigamos se o poro do P2X7 necessita deum segundo mensageiro, se o poro e o canal são a mesma entidade. Usando a configuração cell attached, caracterizamos biofisicamente e farmacologicamente a abertura do poro relacionado ao P2X7 por eletrofisiologia nas células 2BH4 e macrófagos peritoniais de camundongos. As correntes unitárias registradas nessas células após a aplicação de 1mM ATPmostraram condutância de 445 ± 18pS, e esse efeito foi bloqueado por antagonistas do receptor P2X7. Usando diferentes configurações do patch clamp, demonstramos que a atividade de canal iônico de ~8pS e do poro de ~400pS são bloqueadas, independentemente, pelo calmidazólio e pelo5-(N, N-hexamethileno)- amiloride (HMA), bloqueadores do canal e do poro, respectivamente. Além disso, observamos que o poro somente se abre, na configuração cell attached ou whole cell quando o conteúdo citoplasmático é preservado. Nesse sentido, investigamos se o cálcio seria o segundomensageiro envolvido na abertura do poro P2X7. Diminuindo de forma decrescente a concentração Ca2+da pipeta, usando na configuração whole cell, observamos a redução da abertura do poro P2X7. Esse efeito foi reproduzido pelo quelante de Ca2+, BAPTA-AM, na configuração cell attached. A partir desses dados, averiguamos se o aumento massivo da concentração de cálcio intracelularnas células que expressam o receptor P2X7 ou nas células que não expressam (HEK-293 e IT45- RI), induziria a abertura do poro pelo P2X7. Nas células 2BH4, a estimulação com 10amp;#956;M ionomicina na configuração cell attached, induziu a formação de um poro, similar ao do P2X7, com condutânciade 421 ± 14 pS. Interessantemente, as células HEK-293 também abriram um poro (415 ± 10, 4 pS) quando estimuladas com ionomicina. Demonstrando que o cálcio intracelular pode ativar a formação de um poro distinto do P2X7. Baseado no fato do novo poro descoberto possuir um cut off similar aoporo associado ao P2X7, assim como ao poro formado pela maitotoxina e por hemicanais, investigamos se os hemicanais presentes em timócitos teriam atividade funcional e se seriam opróprio poro associado ao P2X7. Sendo assim, observamos que a atividade dos hemicanais é modulada pela aplicação de glicocorticóides que está envolvida com a morte dessas células. Além disso, concluímos que a abertura dos hemicanais não está relacionada com a atividade de poro do receptor P2X7. Resumidamente, nossos dados indicam que esses poros possam ser a mesma entidade ativada por estímulos diferentes e vias de sinalização intracelular distintas, no entanto com propriedades biofísicas semelhantes.
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Bibliographical Information:

Advisor:Luiz Anastácio Alves

School:Faculdades Oswaldo Cruz

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:BIOLOGIA MOLECULAR

ISBN:

Date of Publication:09/04/2006

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