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Estudio estructural y funcional de las cinamil alcohol deshidrogenasas de Saccharomyces cerevisiae

by Larroy Hernando, Carolina

Abstract (Summary)
En esta memoria se presenta la identificación y posterior estudio de las características cinéticas, estructurales y funcionales de dos nuevas alcohol deshidrogenasas de Saccharomyces cerevisiae con actividad dependiente de NADP(H). Ambos enzimas, que comparten un 64% de identidad, pertenecen a la superfamilia de alcohol deshidrogenasas de cadena media que unen zinc. Este trabajo se ha estructurado en capítulos en base a la publicación de los datos presentados. En el Capítulo I se presenta la identificación y caracterización de Adh6p con dos publicaciones referentes a la identificación del ORF YMR318C como el gen ADH6 y la siguiente determinación de las propiedades fisicoquímicas y cinéticas de Adh6p. Se trata de una proteína homodimérica compuesta por subunidades de 40 kD, activa con alcoholes primarios o aldehídos en presencia de NADP(H). En el Capítulo II se presenta la identificación y caracterización de Adh7p con una publicación en la que se identifica al ORF YCR105W como el gen ADH7. Las propiedades fisicoquímicas y cinéticas de Adh7p resultaron muy similares a las ya encontradas para Adh6p, ambas proteínas presentaban una amplia especificidad de sustratos, desde alcoholes/aldehídos alifáticos lineales y ramificados hasta alcoholes/aldehídos aromáticos. Tanto Adh6p como Adh7p son más eficientes para la reducción de aldehídos que para la oxidación de sus correspondientes alcoholes (aproximadamente 50-100 veces), por lo que preferentemente funcionaran como reductasas dependientes de NADPH. También se clasifica a estas dos alcohol deshidrogenasas como miembros de la familia de las cinamil alcohol deshidrogenasas, y dadas sus características de secuencia y de especificidad de sustrato, se las clasifica más concretamente dentro de la subfamilia de las CAD-emparentadas. En el Capítulo III se presenta la estructura tridimensional de Adh6p como publicación. La resolución de dicha estructura reveló el patrón característico de las ADHs de cadena media: la subunidad de Adh6p está estructurada en dos dominios, uno estructural y otro de unión al cofactor, separados por una profunda hendidura que aloja el centro de unión a sustrato. También se han identificado los dos iones de zinc, uno con función estructural coordinado por cuatro cisteínas (cisteínas 100, 103, 106 y 113) y otro con función catalítica, coordinado por la His68 y las Cisteínas 46 y 143, siendo el cuarto ligando una molécula de agua que será desplazada por el sustrato en la catálisis. La resolución de la estructura ha permitido identificar los residuos implicados en la unión al coenzima y al substrato. Los datos estructurales obtenidos ponen de manifiesto una heterogeneidad en la unión al coenzima. Al parecer, sólo una de las dos subunidades de Adh6p presenta una alta afinidad por el cofactor, datos que han sido ratificados por estudios de cuantificación de la estequiometría de la unión Adh6p-NADPH. Los datos obtenidos nos han permitido realizar una hipótesis sobre su mecanismo catalítico, que al parecer presenta half-of-the-sites reactivity. En el Capítulo IV se presentan estudios no publicados sobre la función de Adh6p y Adh7p en la levadura. Se ha estudiado la implicación de estos enzimas en la asimilación de productos procedentes de la degradación de la lignina. Los estudios realizados demuestran que Adh6p es la responsable de la desintoxicación de estos productos. Adh7p también tendría un papel en la asimilación de estos aldehídos, pero sería tan solo un papel de apoyo. Los estudios realizados en condiciones de estrés oxidativo demuestran que Adh6p participa en la respuesta al estrés oxidativo. También se ha demostrado que Adh6p es la responsable de la reducción del 3-metilbutanal en la levadura. Finalmente, en estudios comparativos de la cepa silvestre con la cepa adh1? han demostrado la implicación de Adh6p en el mantenimiento intracelular del balance redox NADP+/NADPH.
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Bibliographical Information:

Advisor:Biosca Vaqué, Josep Antoni; Parés Casasampera, Xavier

School:Universitat Autónoma de Barcelona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:406 departament de bioquimica i biologia molecular

ISBN:

Date of Publication:06/30/2006

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