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Estudio del metabolismo energético de los espermatozoides porcinos y su repercusión en el diseño de diluyentes optimizados para la conservación de semen refrigerado

by Medrano Díaz, Antonio Arvelo

Abstract (Summary)
El primer objetivo de este estudio fue determinar los mecanismos de utilización energética de diferentes monosacáridos (glucosa, fructosa, manosa y sorbitol), por parte de los espermatozoides de cerdo. Para ello, los espermatozoides fueron incubados sin ningún sustrato energético y con diferentes hexosas. Las concentraciones utilizadas de las hexosas fueron de 10 mM, siempre que se quería determinar el efecto del tiempo de incubación, y de 1mM, 5mM, 10mM, 20 mM, 50mM cuando lo que se pretendía determinar era el efecto de la concentración del sustrato metabolizable. Las incubaciones se realizaron durante 5 min., 15 min., 30 min., y 60 min., para el caso del efecto tiempo, y durante 60 minutos para analizar el efecto concentración. Las incubaciones fueron realizadas en un medio de Krebs-Ringer-Henseleit carente de substratos energéticos. Tras estas incubaciones, se determinaron tanto la viabilidad como el estado de los acrosomas como marcadores funcionales del estado de los espermatozoides. También se determinaron los niveles intracelulares de algunos metabolitos energéticos, como la glucosa 6-fosfato, el glucógeno y el trifosfato de adenosina (ATP). Además, también se midió el ritmo de formación de L-lactato extracelular proveniente de la glucólisis y el de CO2 como producto final del ciclo de Krebs. La conclusión más relevante extraída de este estudio fue que la glucosa es el monosacárido utilizado preferentemente por los espermatozoides de cerdo. Esta glucosa es metabolizada principalmente por la vía glucolítica (en un 99%). Finalmente, el control de la vía de consumo de la glucosa se realiza básicamente en dos puntos, el primero la modulación de la actividad hexoquinasa, y el segundo la modulación de la actividad piruvato quinasa. Como complementación del estudio anterior, también se estudió el comportamiento cinético de las principales actividades enzimáticas que controlan la ruta glucolítica, como son la hexoquinasa, que regula la fosforilación inicial de los monosacáridos, y la piruvato quinasa, que regula la introducción del producto final de la glucólisis en el ciclo de Krebs. Estos estudios mostraron que la hexoquinasa tiene una afinidad muy superior hacia la glucosa cuando la comparamos con los otros monosacáridos estudiados, mientras que la piruvato quinasa muestra una gran dependencia en su actividad del equilibrio intracelular entre los niveles de bifosfato de adenosina (ADP) y de ATP, lo que permite un control muy sensible de la obtención de energía a través del flujo glucolítico. Finalmente, también se evaluó el patrón de fosforilación en residuos de tirosina en los espermatozoides de cerdo. Los extractos celulares mostraron un patrón uniforme, con una banda de fosforilación mayoritaria a 45 Kda de peso. Este patrón no sufrió cambios significativos tras la incubación con cualquiera de los azúcares. Este resultado indica la falta de una acción moduladora específica de los azúcares sobre la funcionalidad espermática porcina. Otro de los objetivos consistió en evaluar la utilización de sustratos no glucolisables, y por lo tanto, no utilizables a través de la glucólisis, para la obtención de energía como el citrato y el lactato por parte de los espermatozoides de cerdo. El diseño experimental sobre concentraciones y tiempos de incubación fue igual al ya descrito para los monosacáridos. Las incubaciones también se realizaron en un medio de Krebs-Ringer-Henseleit carente de azúcares, y los parámetros evaluados fueron los mismos que en la primera fase de este trabajo. Además, en este caso se determinó el comportamiento cinético de la actividad lactato deshidrogenasa (LDH) como punto clave de control de la entrada de substratos hacia el ciclo de Krebs. Este estudió estableció la presencia de un tipo de LDH específico de esperma en el espermatozoide de cerdo, lo que fue evidenciado a través del análisis del Western blot y confirmado por los resultados de inmunocitoquímica, los cuales mostraron una reacción positiva en la pieza principal de la cola, con una débil señal en la pieza intermedia. La conclusión principal que se pudo deducir de los resultados obtenidos con los substratos no glucolisables fue que los espermatozoides de cerdo pueden utilizar eficientemente como única fuente de energía tanto el citrato como el lactato, la utilización de estos sustratos se lleva a cabo a través de vías energéticas controladas por la LDH, es decir, básicamente el ciclo de Krebs, siendo el ritmo de flujo asimismo estrechamente regulado por los niveles intracelulares de ATP. También se evaluó en este caso el efecto de la incubación con citrato o lactato sobre el patrón de fosforilación en residuos de tirosina. En este caso, al incubar con 10 mM de citrato o lactato se observó un aumento notable de la intensidad de todas las bandas, especialmente de la de 45Kda, si bien no aparecían cambios significativos en el patrón de bandas específico de fosforilación, este resultado indica igualmente una falta de acción específica de los sustratos sobre la funcionalidad espermática. El objetivo final de nuestro trabajo fue el diseño de cuatro fórmulas experimentales, que combinaran un monosacárido a diferentes concentraciones con un sustrato no glucolisable (citrato o lactato a diferentes concentraciones), con el objetivo primordial de estudiar el efecto que tiene estos cambios en el tipo específico de suministro energético en la conservación a largo plazo en refrigeración. La finalidad subyacente a este estudio fue la de obtener información para la obtención de un diluyente de conservación de semen refrigerado porcino que lograra sobrepasar los 7 días de conservación entre 15 y 17ºC. Para evaluar la eficacia de estas cuatro formulas en la conservación de semen refrigerado de cerdo se midieron los siguientes parámetros: Los porcentajes de viabilidad y de acrosomas alterados, como indicadores del estado funcional del espermatozoide, el ritmo de formación de lactato, los Tests de Resistencia Osmótica (ORT) y de Resistencia Hiperosmótica (HRT), como las pruebas de mayor significación para evaluar la calidad de los espermatozoides, tal y como ha sido descrito en publicaciones previas. La conclusión final fue que un medio que contenga niveles altos de glucosa (siempre inferiores a los que contienen los diluyentes comerciales más ampliamente utilizados) y niveles relativamente bajos de lactato como fuente alternativa de energía permite una conservación de los espermatozoides porcinos a temperaturas entre 15-17ºC por un tiempo mayor a lo observado incluso en diluyentes comerciales utilizados ampliamente, como el BTS. Por lo tanto, un diseño optimizado de las fuentes energéticas glucolíticas y no glucolíticas es imprescindible para la mejora de los diluyentes de semen porcino en refrigeración.
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Bibliographical Information:

Advisor:Rodríguez Gil, Joan Enric

School:Universitat Autónoma de Barcelona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:458 departament de ciències animals i dels aliments

ISBN:

Date of Publication:06/21/2005

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