Details

Estabilitat conformacional de variants de la ribonucleasa A: pressió i temperatura com a inductors dels desplegament proteic

by Torrent i Mas, Joan

Abstract (Summary)
RESUMEN Para analizar la contribución de la región C-terminal propuesta como iniciadora del plegamiento (CFIS 106-118) en la estabilidad de la RNasa A, los residuos alifáticos de esta región fueron sustituidos, mediante mutagénesis dirigida, por otros residuos en los cuales la cadena lateral alifática era progresivamente recortada. La mayor parte de las sustituciones proyectadas suponían deleciones no disruptivas de grupos metilo(eno). Además, se reemplazó la Tyr115 por un Trp, de forma que, potencialmente, se introducía una única sonda fluorescente, no desestabilizadora, para seguir los cambios conformacionales que se pudieran generar en la región durante el proceso de plegamiento/desplegamiento de la proteína. Tanto los parámetros cinéticos, como los espectros de FTIR y CD, determinados para cada una de las ribonucleasas variantes, indican que las sustituciones aminoacídicas efectuadas presentan, en general, poco o ningún efecto en la estructura nativa y en la actividad de la enzima. Se utilizó la espectroscopia de absorción ultravioleta de cuarta derivada, la fluorescencia (para la variante con Trp) y la espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier, para seguir y caracterizar, en condiciones de equilibrio, las transiciones conformacionales de cada variante en función de la presión y de la temperatura. Los resultados se compararon con los que se obtuvieron por la proteína salvaje. Para determinar más a fondo las características del proceso de desplegamiento de la variante Y115W, las transiciones de desnaturalización inducidas por urea de esta variante y de la proteína salvaje, fueron examinadas mediante electroforesis en gradiente de urea y espectroscopia de fluorescencia. Curiosamente, los cambios conformacionales que resultan de la desnaturalización por presión son muy parecidas a los que se obtuvieron por temperatura. Enfrente de un aumento gradual tanto de presión como de temperatura, la estructura terciaria i los elementos de estructura secundaria de las proteínas estudiadas se pierden de forma conjunta y reversible. Estas variaciones estructurales que se promueven describen un proceso de desplegamiento muy cooperativo y en dos estados. Dado que las dos técnicas (UV y FTIR) utilizan cada una un régimen de concentración proteica muy diferente, los resultados indican que el proceso de desplegamiento por presión y por temperatura es intramolecular. Los resultados obtenidos sugieren que la hidrofobicidad y el volumen de las cadenas laterales del CFIS, junto con las interacciones de van der Waals entre elementos de estructura secundaria intervienen de forma muy notable en la estabilización de la proteína. Entre los diferentes aminoácidos alifáticos que pertenecen al CFIS C-terminal, la Val108 es el residuo más importante para preservar la integridad estructural del estado nativo. Las sustituciones en esta posición causan pequeñas alteraciones conformacionales y una gran desestabilización de la proteína (por ejemplo, el punto medio de la transición de desnaturalización por presión y por temperatura de la variante V108G disminuye unos 592 MPa y 25ºC, respectivamente, respecto a la proteína salvaje). De acuerdo con los resultados obtenidos, la variante Y115W ofrece una sonda útil para seguir la cinética de plegamiento/desplegamiento de la RNasa A.
This document abstract is also available in Catalan and English.
Document Full Text
The full text for this document is available in Catalan.
Bibliographical Information:

Advisor:Vilanova i Brugués, Maria; Ribó i Panosa, Marc

School:Universitat de Girona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:b biologia

ISBN:

Date of Publication:07/26/2000

© 2009 OpenThesis.org. All Rights Reserved.