Details

Estabilitat conformacional de variants de la ribonucleasa A: pressió i temperatura com a inductors dels desplegament proteic

by Torrent i Mas, Joan

Abstract (Summary)
RESUM A fi danalitzar la contribució de la regió C-terminal proposada com a iniciadora del plegament (CFIS 106-118) a lestabilitat de lRNasa A, els residus alifàtics daquesta regió es van substituir, mitjançant mutagènesi dirigida, per altres residus en els quals la cadena lateral alifàtica era rogressivament escurçada. La major part de les substitucions projectades suposaven delecions no disruptives de grups metil(è). A més, es va reemplaçar la Tyr115 per un Trp, de manera que, potencialment, sintroduïa una única sonda fluorescent, no desestabilitzant, per tal de seguir els canvis conformacionals que es poguessin generar en la regió durant el procés de legament/desplegament de la proteïna. Tant els paràmetres cinètics, com els espectres dFTIR i CD, determinats per cadascuna de les ribonucleases variants, indiquen que els reemplaçaments aminoacídics efectuats presenten, en general, poc o cap efecte en lestructura nativa i en lactivitat de lenzim. Es va emprar lespectroscòpia dabsorció a lultraviolat de quarta derivada, la fluorescència (per la variant amb Trp) i lespectroscòpia dinfraroig per transformada de Fourier, per tal de seguir i caracteritzar, en condicions dequilibri, les transicions conformacionals de cada variant en funció de la pressió i de la temperatura. Els resultats es van comparar amb els que es van obtenir per la proteïna salvatge. Per determinar més a fons les característiques del procés de desplegament de la variant Y115W, les transicions de desnaturalització induïdes per urea daquesta variant i de la proteïna salvatge, van ésser examinades per mitjà delectroforesi en gradient durea i espectroscòpia de fluorescència. Curiosament, els canvis conformacionals que resulten de la desnaturalització per pressió són molt semblants als que sobtenen per temperatura. Enfront dun augment gradual tant de pressió com de temperatura, lestructura terciària i els elements destructura secundària de les proteïnes estudiades es perden de manera conjunta i reversible. Aquestes variacions estructurals que es promouen descriuen un procés de desplegament molt cooperatiu i en dos estats. Atès que ambdues tècniques (UV i FTIR) utilitzen cadascuna un règim de concentració proteica molt diferent, els resultats indiquen que el procés de desplegament per pressió i per temperatura és intramolecular. Els resultats obtinguts suggereixen que la hidrofobicitat i el volum de les cadenes laterals del CFIS, juntament amb les interaccions de van der Waals entre elements destructura secundària intervenen de manera molt notable en lestabilització de la proteïna. Entre els diferents aminoàcids alifàtics que pertanyen al CFIS C-terminal, la Val108 és el residu més important per tal de preservar la integritat estructural de lestat natiu. Els reemplaçaments en aquesta posició causen petites alteracions conformacionals i una gran desestabilització de la proteïna (per exemple, el punt mig de la transició de desnaturalització per pressió i per temperatura de la variant V108G disminueix uns 592 MPa i 25ºC, respectivament, respecte a la proteïna salvatge). Dacord amb els resultats obtinguts, la variant Y115W ofereix una sonda útil per tal de seguir la cinètica de plegament/desplegament de lRNasa A.
This document abstract is also available in English and Spanish.
Bibliographical Information:

Advisor:Vilanova i Brugués, Maria; Ribó i Panosa, Marc

School:Universitat de Girona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:b biologia

ISBN:

Date of Publication:07/26/2000

© 2009 OpenThesis.org. All Rights Reserved.