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Enzymatische Ligation von Peptiden, Peptidnucleinsäuren und Proteinen

by Pritz, Stephan

Abstract (Summary)
Peptide und Proteine sind wichtige Untersuchungsobjekte der biochemischen Forschung. Es wurden in den letzten Jahren eine Reihe von Ligationsmethoden entwickelt, um weitgehend entschützte, gereinigte Peptidsequenzen im wässrigen Milieu zu koppeln. Vor diesem Hintergrund von besonderem Interesse für einen möglichen Einsatz bei Ligationen ist die bakterielle Transpeptidase Sortase A. Dieses Enzym ist in vivo an der Anknüpfung von Proteinen an das bakterielle Peptidoglycan beteiligt, wobei es Substrate an einem LPXTG-Motiv zwischen Threonin und Glycin spaltet und auf ein Oligoglycin-Nucleophil überträgt. Zur Untersuchung der Enzymaktivität wurde in dieser Arbeit ein einfacher HPLC-basierter Assay etabliert. Die an Peptidmodellen gewonnenen Resultate wurden schließlich für den Aufbau eines löslichen Rezeptors genutzt. Ein Schlüsselschritt war die Sortase-vermittelte Ligation des in E. coli exprimierten, gefalteten Rezeptor-N-Terminus an ein 3-Loop-Konstrukt. Das erhaltene 23 kDa große Rezeptormimetikum war nach chromatographischer Reinigung homogen gemäß HPLC und MS. Es zeigte eine spezifische, hoch affine Bindung zu natürlichen Peptidliganden des CRF1-Rezeptors. Weiterhin konnte demonstriert werden, dass sich Sortase für die selektive Markierung von Proteinen eignet. So wurde ein Fluoreszenzlabel C-terminal an das 50 kDa Protein NEMO geknüpft. Als weiteres Anwendungsbeispiel der Sortase-vermittelten Ligation diente die Darstellung von PNA–CPP-Konjugaten. Die Verwendung von Überschüssen des Peptides und die Entfernung der niedermolekularen Abgangsgruppe durch Dialyse erwies sich als sehr effektiv und gestattete gute bis hervorragende Kupplungsausbeuten von bis zu 94%. Die biologische Wirkung der erhaltenen CPP–PNA-Konjugate konnte in Aufnahmeuntersuchungen an Zellen gezeigt werden.
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Bibliographical Information:

Advisor:

School:Humboldt-Universität zu Berlin

School Location:Germany

Source Type:Master's Thesis

Keywords:Chemie Chemie

ISBN:

Date of Publication:01/13/2009

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