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Desenvolvimento e avaliação de métodos moleculares para o diagnóstico da dengue.

by Oliveira Poersch, Celina de

Abstract (Summary)
A dengue é hoje a mais importante arbovirose que afeta o homem, constituindo um sério problema de saúde pública no mundo, especialmente em países tropicais onde as condições do meio ambiente favorecem a proliferação dos seus vetores, os mosquitos do gênero Aedes. Atualmente, quase metade da população mundial vive em áreas de risco para a doença e, apesar de sua extensão e gravidade, vacinas ou tratamentos específicos ainda não estão disponíveis. Tendo conhecimento daurgência na melhoria da vigilância epidemiológica da dengue e das deficiências do diagnóstico laboratorial dessa e de outras doenças no país, realizou-se esse trabalho cujo principal objetivo foi o desenvolvimento de métodos diagnósticos baseados em técnicas moleculares de última geração paraa detecção e sorotipagem do vírus da dengue. As metodologias escolhidas foram as de PCR em tempo real e de microarranjo líquido, as quais representam os mais recentes avanços na área de diagnóstico molecular. Diferentes conjuntos de oligonucleotídeos sorotipo- e grupo-específicos foramavaliados quanto a capacidade de amplificar e identificar os sorotipos DENV1, DENV2 e DENV3 pelos dois métodos. Dessa forma, desenvolveu-se, baseado na técnica de PCR em tempo real, três ensaios uniplex sorotipo-específicos para dengue e um teste grupo-específico capaz de amplificar todos os sorotipos do vírus. Para o ensaio baseado na técnica de microarranjo líquido os oligonucleotídeos, após testados individualmente, foram combinados em diferentes formatos multiplex, tanto na reação de amplificação (PCR) como na de hibridação. Diferentes protocolos de hibridação foram também avaliados. Quando testada contra curvas padrões obtidas a partir dadiluição de quantidades conhecidas dos três sorotipos do vírus, a PCR em tempo real mostrou-se, para todos os ensaios, capaz de amplificar e detectar mesmo a menor quantidade de vírus avaliada, equivalente a 53,57 FFU/ml. Já a sensibilidade do teste de microarranjo líquido multiplex foi de 3.428,48 FFU/ml para DENV1 e 53,57 FFU/ml para DENV2 e DENV3, com os oligonucleotídeos sorotipo-específicos e 214,28 FFU/ml para DENV3 e 53,57 FFU/ml para DENV1 e DENV2, com osoligonucleotídeos grupo-específicos. A especificidade dos dois métodos foi de 100%. A fim de avaliar a capacidade desses testes em diagnosticar e sorotipar o vírus da dengue em amostras clínicas, foram usados 50 soros positivos para IgM anti-dengue, 49 negativos por sorologia e 49 soros depacientes cuja positividade para dengue foi confirmada por isolamento viral. A concordância entre os dois métodos foi de 92,5% quando comparados os resultados obtidos com os oligonucleotídeos grupo-específicos e de 90,5% para os ensaios sorotipo-específicos. Tomando o grupo positivo porisolamento viral como referência, o método de microarranjo líquido falhou em detectar três amostras que foram consideradas positivas por PCR em tempo real e detectou uma amostra que não foi detectada na PCR. Embora o método baseado em microarranjo líquido tenha apresentado menorsensibilidade do que a PCR em tempo real, as vantagens de permitir a análise simultânea de diversos alvos, a flexibilidade, versatilidade e custo acessível justificam um maior esforço na otimização desse teste. O presente trabalho serviu, acima de tudo, como um estudo de viabilidade técnica das metodologias citadas para o diagnóstico de doenças virais e, acredita-se, não trará apenas benefícios para o diagnóstico da dengue como também para de várias outras doenças prioritárias para o Brasil.
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Bibliographical Information:

Advisor:Marco Aurélio Krieger

School:Faculdades Oswaldo Cruz

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:BIOLOGIA MOLECULAR Dengue Vírus da Reação em Cadeia Polimerase Virus Animais

ISBN:

Date of Publication:12/21/2007

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