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Desenvolvimento e otimização de métodos de Biologia Molecular para o diagnóstico de Leishimania chagasi e Helicobacter pylori

by Evans Osses, Ingrid Solange

Abstract (Summary)
Neste trabalho foram desenvolvidos e otimizados métodos diagnósticos para dois agentes patogênicos com uma alta incidência no Brasil e cujos diagnósticos se baseiam principalmente em métodos invasivos como são o Helicobacter pylori e Leishmania chagasi (L. chagasi). A bactéria gram (-) Helicobacter pylori e a principal causa de ulcera péptica e gastrite maligna no mundo. Seu diagnostico e realizado preferencialmente por meio de endoscopia e biopsia de tecido gástrico. A bactéria e eliminada pelas fezes o que permitiria um diagnostico não invasivo e de controle de cura se implementar PCR de amostras de pacientes antes e durante o tratamento de doença. Não entanto as fezes possuem uma serie de inibidores o que tem dificultado o desenvolvimento de métodos de PCR para seu diagnostico. Aqui comparamos métodos de obtenção de DNA de fezes baseados em fervura das amostras descritos anteriormente por Holland (2000), com método de Lise Alcalina , modificado com o uso de Triton X-100 melhorando a obtenção de DNA eliminando a presencia de inibidores. Posteriormente DNAs provenientes de amostras de fezes de 10 pacientes foram utilizados em reações de PCR com alvos específicos descritos anteriormente para Helicobacter pylori (urec, RNAr e vac); 5 das amostras amplificaram de maneira especifica concordando com o diagnostico Giemsa (+) de biopsia de tecido gástrico de pacientes com dispepsia. L. chagasi, protozoário responsável de causar a leishmanioses visceral, no Brasil apresenta uma alta incidência e ampla distribuição, com formas graves e letais quando associada a quadros de ma nutrição e infecções concomitantes. O diagnostico e realizado principalmente por punção aspirativa de baço, fígado, medula óssea ou linfonodos permitindo a visualização do parasita no material. No presente trabalho desenvolvemos PCR simples usando diferentes DNAs parasitários de tripanosomatideos e oligonucleotideos PIA 3 e DEB 8 específicos para L. chagasi.. Os dois pares de oligonucleotideos resultaram serem específicos para L.chagasi, sendo a sensibilidade de 10 pg para PIA3 e de 1 pg para DEB8. Com o objetivo de diferenciar o diagnostico de Leishmaniose visceral e Leishmanioses tegumentar foi desenvolvida PCR múltipla utilizando alvos específicos para leishmania subgênero Viannia, denominados LV1 junto com os alvos específicos para L. chagasi . Os 4 oligonucleotideos não competeram entre sim na reação e mantiveram a especificidade e sensibilidade das PCR simples.Posteriormente um analise de bioinformática dos bancos de dados dos genes de Tripanosomatideos do portal GeneDB do Sanger Centre foi realizado na procura de um gene órfão de L. infantum para ser usado no diagnostico de L chagasi. 7.078 proteinas hipotéticas de L. infantum, foram comparados com 11.812 de T cruzi, 7557 de T brucei e 5.364 de L major. Através das ferramentas omni blast e Protogim, conseguimos seleccionar 93 proteinas hipotéticas de L infantum. Por critérios de tamanho, localização celular e outros, 5 putativos alvos foram escolhidos para serem testados in vitro. O gene Linj 20074, resultou ser altamente especifico e com sensibilidade de 1pg. Genes órfãos se apresentam como promissores alternativas para diagnostico ou alvo quimioterapicos em doenças parasitarias
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Bibliographical Information:

Advisor:Paulo Paes de Andrade

School:Universidade Federal de Pernambuco

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:Biologia Molecular

ISBN:

Date of Publication:03/10/2006

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