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Desenvolvimento de novos insumos para o diagnóstico sorológico da dengue: antígenos virais nativos e recombinates.

by Borba, Luana de

Abstract (Summary)
Dengue é hoje a principal arbovirose tropical, em termos de morbilidade e mortalidade. É transmitida ao homem através da picada de mosquitos do gênero Aedes sendo responsável por 100 milhões de casos da doença (DF) por ano, e maisde 500 mil casos da forma hemorrágica (DHF). A situação epidemiológica no Brasil é alarmante, pois o país contribui com 80% dos casos de dengue das Américas. O vírus da dengue pertence à família Flaviviridae e possui 4 sorotipos caracterizados (DEN1, DEN2, DEN3 e DEN4) e até o momento não existe uma vacina disponível.Um diagnóstico rápido e eficiente pode confirmar casos suspeitos de dengue e direcionar tratamentos e prognósticos. Entre os testes diagnósticos para dengue, omais comum é o ELISA (ensaio imuno-enzimático), sendo um método relativamente rápido, fácil e que pode ser realizado em um grande número de amostras simultaneamente. Os antígenos normalmente utilizados são partículas virais inativadas provenientes de cultura celular ou extratos brutos, como macerado de células de cérebro de camundongos infectados com o vírus, que esbarra em limitações como: variação existente entre lotes, crescente problema de bioética relacionado ao uso de animais de laboratório e risco da manipulação de material patogênico. Uma boa alternativa seria a utilização de antígenos recombinantes que pudessem substituir os utilizados atualmente, apresentando resultados reprodutíveis, menor custo e maior segurança. A fim de contribuir para melhoria do diagnóstico sorológico no Brasil, os principais objetivos deste trabalho foram: I. Obtenção deantígenos virais inativados de maior qualidade, II. Produção de um painel de antígenos recombinantes dos quatro sorotipos do vírus, III. Testar a aplicabilidade destes antígenos em testes diagnósticos sorológicos para dengue. Os antígenosnativos IBMP foram obtidos pela infecção de vírus em células C6/36 e etapas de precipitação, concentração e inativação. Como antígenos recombinantes foram escolhidos o epítopo B da proteína E, por ser um domínio antigênico exposto nasuperfície da molécula e bastante reativo com soro de pacientes, e as proteínas prM e E que foram expressas de forma quimérica e deletadas das regiões de ancoragemhidrofóbicas (prM/EDH). Todas as proteínas foram expressas em grandes quantidades no sistema procariótico Qiaexpressionist. Dois formatos de teste foramempregados: ELISA e imunodetecção em membranas (Immunoblotting), usando 44 soros de pacientes positivos e negativos para dengue, e soros de pacientesvacinados contra febre amarela. Os antígenos nativos IBMP foram testados em paralelo com o antígeno produzido em cérebro de camundongos (kit de Bio- Manguinhos) e com o kit diagnóstico comercial PanBio (neste caso usado como contra-prova), usando o mesmo painel de soros. Os melhores resultados foram obtidos com o antígeno IBMP, que apresentou reatividade com 95,4% dos sorospositivos contra 90,9% de Bio-Manguinhos, mostrando-se mais sensíveis e específicos. Os resultados de ELISA com os antígenos recombinantes DomB não foram satisfatórios, pois houve reação inespecífica com soros negativos, no momento estamos investindo na melhoria do antígeno, utilizando como alternativa a conjugação das proteínas com enzimas. O antígeno recombinante prM/EDH foi testado em ensaios de Immunoblotting para detecção de IgM e IgG. Os resultados foram bastante promissores e estão sendo padronizados.
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Bibliographical Information:

Advisor:Claudia Nunes Duarte dos Santos

School:Faculdades Oswaldo Cruz

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:Dengue antígenos virais nativos e recombinates BIOLOGIA MOLECULAR

ISBN:

Date of Publication:12/17/2004

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