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Desenvolvimento de novas abordagens moleculares baseadas em PCR (reação em cadeia da polimerase) para detecção genero-específica de Plasmodium

by Lapa Montenegro, Lilian Maria

Abstract (Summary)
Oligonucleotídeos foram construídos com base na sequência primária do gene codificando o rRNA de Plasmodium para amplificar DNA de P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale, de maneira gênero-específica. Três sistemas de PCR foram utilizados: PCR simples, ?hemi-nested? PCR convencional e?hemi-nested? PCR em um único tubo, desenvolvidos em nosso laboratório. Na PCR simples, composta de 30 ciclos, foram utilizados os oligonucleotídeos GJ1 e HR842 (20 pmol/50amp;#956;l), já testados por nosso grupo. Na ?hemi-nested PCR convencional utilizou-se três oligonucleotídeos (GJ1, PGFO3 e HR842), emduas reações sequenciais, sendo o PGFO3 construído durante odesenvolvimento do presente trabalho, visando a detecção do gênero Plasmodium. O par GJ1 e HR842 foram utilizados como oligonucleotídeos externos na primeira reação, e o PGFO3 como interno, ancorado ao HR842 na segunda reação. A ?hemi-nested? PCR em um único tubo consistiu em 60 ciclos (92ºC, 30s; 58ºC, 30s e 72ºC, 45s), e concentrações limitantes de oligonucleotídeos externos (4 pmols/50amp;#956;l) participavam da PCR sem competição com os oligonucleotídeos internos durante os primeiros 15 ciclos da reação e 40 pmol/50amp;#956;l de primers internos (imobilizados na face interna da tampa do microtubo) foram introduzidos na PCR no 16º ciclo. As concentrações dos outros componentes da reação foram as mesmas utilizadas nas reaçõesconvencionais de PCR. Observou-se que a quantidade mínima de DNA genômico detectada pela PCR simples, ?hemi-nested? PCR e ?hemi-nested? PCR em um único tubo foi de 10 pg; 0,01 pg e 0,1 pg, respectivamente. Apesar da ?hemi-nested? PCR em um único tubo ter sido menos sensível que a ?heminested? PCR convencional, é muito mais simples e conveniente, já que o riscode contaminação cruzada é bem menor. Esses sistemas moleculares de diagnóstico podem ser usados em situações quando se requer uma alta sensibilidade e especificidade, tais como na avaliação da eficiência de quimioterapia, detecção precoce de infecção e prevenção de transmissão a partir de pacientes hipoparasitêmicos
Bibliographical Information:

Advisor:Haiana Charifker Schindler

School:Universidade Federal de Pernambuco

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:abordagens moleculares pcr detecção de plasmodium biofisica

ISBN:

Date of Publication:05/27/2002

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