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Cultivo primario para el estudio de la función osteoblástica

by Ruiz Gaspà, Sílvia

Abstract (Summary)
Introducción: Los cultivos de osteoblastos humanos obtenidos de explantes óseos son un buen modelo de estudio de la funcionalidad osteoblástica. Existe una elevada correlación entre la actividad celular que presentan los osteoblastos in vitro e in vivo (biopsias óseas). El cultivo primario de osteoblastos derivados de hueso trabecular es el mejor modelo para el estudio de anomalías intrínsecas de las células de pacientes con enfermedades metabólicas óseas. Las estatinas o inhibidores específicos del enzima HMG-CoA reductasa actúan inhibiendo la síntesis hepática de colesterol. Las estatinas son utilizadas para disminuir los niveles de colesterol y proporcionar una importante vía de abordaje en el tratamiento de la hiperlipidemia y arteriosclerosis. En los últimos años se ha visto que pueden tener efectos pleiotrópicos en el hueso. El objetivo del trabajo fue analizar la implicación de la funcionalidad osteoblástica en el metabolismo del hueso mediante cultivo primario de osteoblastos humanos. De esta manera el trabajo se ha separado en cuatro subestudios diferentes que tienen como columna vertebral el cultivo primario para el estudio de la función osteoblástica. Objetivos: Subestudio I: Análisis del cultivo primario de osteoblastos humanos y la línea tumoral MG-63 como modelo para el estudio de patologías metabólicas óseas y el efecto de factores reguladores y de fármacos en el hueso. Subestudio II: Estudio de la proliferación celular y de la expresión génica del sistema OPG/RANKL, los factores Cbfa1 y BMP-2, y el colágeno tipo 1 y la osteocalcina, en cultivo primario de osteoblastos de pacientes con osteoporosis posmenopáusica. Subestudio III: Análisis del efecto de la simvastatina y la atorvastatina sobre la proliferación celular y la expresión génica del BMP-2, el colágeno tipo 1 y la osteocalcina en osteoblastos humanos primarios normales y la línea celular MG-63. Subestudio IV: Estudio de la proliferación celular y de la expresión génica del colágeno tipo 1 y la osteocalcina en cultivo primario de osteoblastos de varones con osteoporosis idiopática. Metodología: Para el cultivo primario de osteoblastos humanos se utilizaron muestras de rodilla, de cabeza de fémur y de cresta ilíaca. Se extrajo el hueso trabecular y se troceó en explantes de 1mm3. Los explantes fueron lavados mediante agitación mecánica con una solución salina y depositados sobre una placa de Petri con medio completo suplementado con suero. Pasadas aproximadamente cuatro semanas el cultivo llegaba a la confluencia y en este momento, previamente a realizar experimentos se procedía a la caracterización de los osteoblastos mediante la detección de la actividad fosfatasa alcalina y la expresión génica de la osteocalcina, usando en ambos casos fibroblastos humanos primarios como control negativo. Para la cuantificación de la expresión de los genes analizados en cada subestudio se utilizó la técnica de la PCR a tiempo real. A partir de las células tratadas de forma específica en cada uno de los subestudios se realizó la extracción de RNA total utilizando el método del Trizol. Cada una de las muestras de RNA aislado se evaluó su integridad mediante un gel de agarosa y se cuantificó para la posterior reacción de retrotranscripción a partir de 1mg de RNA. Finalmente se cuantificaron los niveles de expresión génica mediante la PCR a tiempo real. Esta técnica consiste en monitorizar la reacción de PCR a medida que ésta tiene lugar. Se realizó mediante la tecnología TacMan que utiliza unas sondas fluorogénicas que permiten la detección de los productos de PCR específicos a medida que se van sintetizando. En esta técnica se marca un umbral de fluorescencia en un punto donde la reacción se encuentra en fase exponencial. El ciclo en el cual la reacción de amplificación atraviesa el umbral de fluorescencia se denomina Ct (Treshold Cycle) y depende de la cantidad de cDNApresente en la muestra. Resultados: Subestudio I: Todas las líneas de osteoblastos primarios utilizadas mostraron fenotipo osteoblástico ya que todas ellas presentaron actividad fosfatasa alcalina y expresaron el gen de la osteocalcina. Subestudio II: Se obtuvieron un total de 21 muestras procedentes de mujeres menopáusicas sometidas a intervención quirúrgica por prótesis de rodilla. Se separaron en dos grupos en función de patología osteoporótica siguiendo los criterios densitométricos de la OMS de -2.5DS. Resultó un total de 9 muestras en el grupo de pacientes osteoporóticas y 12 muestras en el grupo de pacientes no osteoporóticas. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en la proliferación celular entre los dos grupos. Se observó una disminución estadísticamente significativa en los niveles de expresión génica y COL1A1 en el grupo de pacientes osteoporóticas. Se observó una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de expresión génica de OPG bajo el estímulo de vitamina D y 17?-estradiol. Subestudio III: Se observó una disminución estadísticamente significativa de la proliferación celular en los cultivos tratados con distintas concentraciones de simbastatina y atorvastatina en los osteoblastos primarios y en la línea celular MG-63. Se observó un aumento de la expresión génica de COL1A1, osteocalcina y BMP-2 en los osteoblastos primarios y en la línea celular MG-63. Subestudio IV: Se obtuvieron un total de 30 muestras procedentes de biopsia de cresta ilíaca de pacientes varones. Se separaron en dos grupos en función de patología osteoporótica siguiendo los criterios densitométricos de la OMS de -2.5DS. Resultó un total de 14 muestras en el grupo de pacientes osteoporóticas y 16 muestras en el grupo de pacientes no osteoporóticas. Se observó una disminución estadísticamente significativa de la proliferación celular en las muestras del grupo de pacientes osteoporóticos. Se observó una tendencia a la disminución de la expresión génica de COL1A1 en condiciones basales y con vitamina D en el medio. Se observó una disminución estadísticamente significativa de los niveles de expresión génica de osteocalcina en presencia de vitamina D en las muestras del grupo de pacientes con osteoporosis. Conclusiones: Subestudio I: El cultivo primario de osteoblastos es un buen modelo para el estudio de patologías metabólicas óseas (como la osteoporosis) y del efecto de factores y fármacos en el hueso. Subestudio II: Los osteoblastos procedentes de pacientes con osteoporosis posmenopáusica tienen un defecto que afecta a la expresión de genes característicos de la función osteoblástica. Subestudio III: Las estatinas (simvastatina y atorvastatina) afectan a la función osteoblástica favoreciendo la diferenciación a través de la inhibición de la proliferación celular y el incremento de la expresión de genes característicos del osteoblasto diferenciado con elevada actividad secretora. Subestudio IV: Los osteoblastos procedentes de pacientes con osteoporosis masculina idiopática tienen un defecto que afecta a la proliferación celular y a la expresión de genes característicos de la función osteoblástica.
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Bibliographical Information:

Advisor:Díez Pérez, Adolfo; Nogués Solán, Xavier

School:Universitat Autónoma de Barcelona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:417 departament de medicina

ISBN:

Date of Publication:12/14/2005

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