Cloning, expression, purification and crystallisation of the human ets-1/usf1/dna complex & crystal structure of thermotoga maritima histidinol-phosphate aminotransferase (ec 2.6.1.9)

by Fernández Pérez, Francisco J.

Ets-1 y USF1 son factores de transcripción implicados en muchos procesos fundamentales del desarrollo y la diferenciación celular. Defectos en su regulación se han asociado con desórdenes patológicos e infecciones virales. Ets-1, en particular, es un paradigma del mecanismo de regulación transcripcional en virtud del cual la capacidad de Ets-1 para unir DNA y, por tanto, de transactivación, están silenciadas constitutivamente (autoinhibición). La desrepresión de Ets-1 se puede lograr por medio de interacciones proteína-proteína, que desenmascaran el dominio de unión a DNA de Ets-1 y conducen a la formación de un complejo ternario de gran afinidad entre Ets-1, una proteína compañera y el sitio de unión combinado para ambos factores de transcripción. En este trabajo, emprendimos la elucidación estructural del mecanismo de autoinhibición de Ets-1. Comenzamos con la clonación, expresión y purificación de Ets-1 y las proteínas compañeras USF1 y MafB. A medida que íbamos enfrentando nuevos desafíos, diseñamos métodos y aproximaciones que facilitaran la producción eficaz de proteínas de unión a DNA para biología estructural. Uno de los conceptos fundamentales que ha reaparecido en el presente estudio es la necesidad de proporcionar a cada proteína un entorno lo mas parecido posible al que disfrutan en su contexto biológico. Por ejemplo, la estabilización de Ets-1 no fue posible hasta que se añadió el complejo USF1/DNA , que semeja las condiciones fisiológicas en las que USF1, unido a DNA, recluta Ets-1 sobre su sitio de unión. Hemos producido con éxito un conjunto de complejos ternarios Ets-1/USF1/DNA para los cuales hemos buscado condiciones de cristalización. Hemos obtenido cristales, que hemos probado contienen Ets-1, USF1 y DNA. El refinamiento (optimización) de esas condiciones de cristalización preliminares debería conducir en definitiva a la obtención de cristales de suficiente calidad para difracción. Estos cristales ofrecen la posibilidad de profundizar nuestro conocimiento en un mecanismo de regulación que tiene una importancia capital en enfermedades como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida o muchos tipos de leucemias.