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Cloning and characterization of two glycosidases from the acidothermophile Alicyclobacillus acidocaldarius ATCC27009

by Eckert, Kelvin

Abstract (Summary)
Zwei Glykosylhydrolasen des acidothermophilen Bakteriums Alicyclobacillus acidocaldarius konnten charakterisiert werden. Die jeweiligen Gene wurden kloniert und sequenziert. Das intrazelluläre Enzym CelA und das extrazelluläre Enzym CelB könnten zusammen eine tragende Rolle im Abbau von beta-1,4-verknüpften Polysacchariden spielen. Ein Gen, welches für eine beta-1,4-Endoglucanase (CelA) kodiert, wurde kloniert und überexpremiert. Das Enzym wurde gereinigt. Das Protein besitzt eine Immunoglobulin-ähnliche Domäne, jedoch keine Cellulosebindedomäne. Zusammen mit den Sequenzähnlichkeiten der katalytischen Domäne zeigen diese Merkmale, daß das Protein zur Familie 9, Untergruppe E1 der Glykosylhydrolasen gehört. CelA zeigte höchste Aktivität gegenüber beta-1,4-Glucanen, besaß jedoch auch Aktivität gegen Haferspelzenxylan. Das Enzym hatte ein pH optimum von 5.5 und ein Temperaturoptimum von 70 °C. Im Protein waren zwei Zink- und zwei Calcium-Ionen gebunden, die wahrscheinlich wichtig für die Temperaturstabilität sind. Gegenüber p-Nitrophenylglykosiden ergab sich ein überraschendes Hydrolysemuster: Höchste Aktivität wurde auf dem Cellobiosidderivat gefunden, eine niedrigere Aktivität fand sich auf dem Cellotetraosederivat, wohingegen keine Aktivität auf den Glucose- und Cellotriosederivaten gemessen wurden. Das Hydrolysemuster führte zu dem Schluß, daß in CelA die Bindung von beta-1,4-Glucanen entweder auf der nicht reduzierenden Seite der -2 Substratunterbindestelle sterisch verhindert wird, oder alternativ zwei starke Substratunterbindestellen -1 und -2 vorhanden sind. Es wurde kein Signalpeptid zur Markierung des Proteins für die Translokation über die Membran gefunden. Zusammen mit der hohen Aktivität gegenüber Oligosacchariden, dem fast neutralen pH Optimum und der Inaktivierung bei niedrigem pH, deutet dies auf eine Rolle des Proteins als cytoplasmatisches Enzym zum Abbau importierter Oligosaccharide hin. Ein zweites Enzym mit Xylanase- und Cellulaseaktivität wurde zunächst aus A. acidocaldarius Kulturen gereinigt. CelB besaß eine molekulare Masse von 100 kDa und konnte nur mit Hilfe von Detergenz von den Zellen abgelöst werden. Klonierung und Sequenzanalyse des entsprechenden Gens ergaben einen offenen Leserahmen, welches für ein Präprotein kodierte, das ein typisches Sec-abhängiges Signalpeptid besaß. Gereinigtes, rekombinantes CelB und eine verkürzte Variante, der die letzten 203 Aminosäuren fehlten, zeigten Enzymaktivitäten, die dem Wildtypprotein ähnlich waren. Ein niedriges pH-Optimum von 4 wurde bestimmt. Auch die Stabilität war bei niedrigem pH hoch, wobei das Enzym nach Inkubation über nacht bei pH 1.5 bis 7 eine Restaktivität von 80 % aufwies. Das Temperaturoptimum betrug 80 °C. Bei dieser Temperatur war das Enzym auch stabil und zeigte nach 1 h 60 % Restaktivität. CelB hatte die Spezifität eines Endoenzyms, jedoch wurden nach längeren Inkubationszeiten Cellobiose und Xylobiose aus Cellulose bzw. Xylan freigesetzt. Das Enzym gehörte zur Familie 51 der Glykosylhydrolasen, aber es war erst der zweite Eintrag dieser Familie mit typischer Endoglucanaseaktivität. CelB hatte höchste Sequenzähnlichkeit mit der zweiten Endoglucanase, EGF aus Fibrobacter succinogenes, wobei diese beiden Proteine eine markante Gruppe im phylogenetischen Baum dieser Familie bildeten. Die Analyse der Aminosäurezusammensetzung der katalytischen Domänen ergab, daß CelB in Übereinstimmung mit der Anpassung an einen niedrigen pH-Wert, weniger geladene Aminosäuren als die neutrophilen Enzyme der gleichen Familie besitzt. Wildtyp-CelB und unverkürztes, rekombinantes CelB waren nur in Anwesenheit von Detergenz löslich. Dagegen war das verkürzte CelB Protein vollständig in Wasser löslich. Daher wird eine Rolle der C-terminalen Region bei der Zellassoziation nahegelegt. Dieser hydrophobe Bereich zeigte lokale Übereinstimmungen der Aminosäuresequenz mit einer hydrophoben Region einer Amylase aus dem gleichen Organismus.
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Bibliographical Information:

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School:Humboldt-Universität zu Berlin

School Location:Germany

Source Type:Master's Thesis

Keywords:Biowissenschaften, Biologie

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Date of Publication:02/06/2004

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