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Anaplasma marginale : análise da variabilidade do gene msp1 a e avaliação imunogênica da vacina de DNA contendo genes para MSP1a, MSP1b e MSP5 em camundongos BALB/c

by Kano, Flora Satiko

Abstract (Summary)
O Anaplasma marginale é um importante patógeno riquetsial de bovinos transmitido por carrapato que invade e se multiplica dentro de eritrócitos, causando anemia hemolítica durante a infecção aguda. A imunização com proteínas de membrana externa (OMP) purificadas induz proteção contra doença aguda. Das 21 OMPs descritas, seis MSPs (1a, 1b, 2-5) já foram bem caracterizadas. O complexo MSP1 (MSP1a e 1b) é adesinas de eritrócitos de bovinos. A MSP1a varia em tamanho pelo número de repetições in tandem de 28-29 aminoácidos. Vacina de DNA contra a anaplasmose tem sido investigada usando os genes msp1? e msp1?, e os resultados evidenciaram resposta celular e humoral em camundongos e bovinos. A imunização com DNA plasmidial que codifica genes de interesse é uma tecnologia nova e promissora no desenvolvimento de vacinas. Vacinas de DNA que visam múltiplos epitopos têm se mostrado mais eficientes aumentando a imunogenicidade e a proteção de animais vacinados quando comparadas com as de epitopo único. Os objetivos deste trabalho foram analisar a variabilidade do gene msp1a de amostras paranaenses de A. marginale, testar a capacidade dos plasmídios recombinantes expressarem MSP1a, MSP1b e MSP5 em células eucarióticas e avaliar a imunogenicidade destas vacinas administradas individualmente ou em associação, em camundongos BALB/c. A análise da região repetitiva do gene msp1a identificou a presença de seis, cinco e três repetições nas amostras PR1, PR2 e PR3, respectivamente, e seis padrões de repetições inéditas. Contudo, a região da MSP1a responsável pela imunogenicidade foi conservada. Os plasmídios pcDNA/ msp1a, pcDNA/ msp1 ? e pcDNA/ msp5, os quais codificam os genes das MSPs sob o controle do promotor do citomegalovirus e intron A, foram construídos, multiplicados em E. coli TOPO10 e purificados. A expressão das proteínas MSP1a, MSP1b e MSP5 in vitro foi realizada em células Vero usando lipofectamina 2000 e Imunofluorescência Indireta (IFA), utilizando anticorpos monoclonais. Sete grupos de camundongos foram imunizados para avaliar a produção de IgG total e determinar os isotipos IgG1 e IgG2a: G1-100 mL PBS; G2-100 mg de vetor; G3- 100 mg de corpúsculos iniciais de A. marginale + adjuvante de Freund; G4- 100 mg pcDNA-msp1a; G5-100 mg pcDNA-msp1b; G6-100 mg of pcDNA-msp5 e G7- pool de plasmídios (33 mg de cada plasmídio). Três semanas após a última imunização, os camundongos foram sacrificados para avaliar a proliferação dos esplenócitos. As células Vero transfectadas com plasmídios recombinantes reagiram com anticorpos monoclonais específicos, demonstrando a expressão dos genes msp. IgG específica para a MSP1a e MSP5 foram detectadas tanto por ELISA quanto por Western blot. Os grupos que receberam pcDNA-msp1a and pcDNA-msp5 mostraram predomínio do isotipo IgG2a, e proliferação de esplenócitos, sugerindo que estes plasmídios são bons candidatos para estimular reposta imune Th1. A associação dos três plasmídios recombinantes (pcDNA-msp1a, pcDNA-msp1b and pcDNA-msp5) empregados na imunização de camundongos induziram altos títulos de anticorpos por ELISA e reagiram com todas proteínas recombinantes (rMSP1a, rMSP1b e rMSP5) de A. marginale por Western blot. Adicionalmente, a combinação dos plasmídios levou a uma forte proliferação de linfócitos (SI = 12, 2), enquanto o gene msp1a determinou significante proliferação significativa (SI = 2,6) e os genes msp1b e msp5 não promoveram proliferação (SI<2). Os resultados demonstraram que a associação dos plasmídios induziu a expressão das MSPs e estimulou significante produção de linfócitos T, podendo ser uma estratégia eficiente para a imunoprofilaxia da anaplasmose.
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Bibliographical Information:

Advisor:Odilon Vidotto; Marilda Carlos Vidotto [Orientador].; Amauri A. Alfieri; João Luis Garcia

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Source Type:Master's Thesis

Keywords:Bovino - Doenças Imunologia veterinária

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Date of Publication:04/27/2007

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