Analysis of components of the mitochondrial transcription machinery in Arabidopsis thaliana

by

In der vorliegenden Arbeit wurde die Transkription mitochondrialer Gene durch die kernkodierten Phagentyp-RNA-Polymerasen RpoTm und RpoTmp der Pflanze Arabidopsis untersucht. Im Mitochondriengenom von Arabidopsis wurden für 12 Gene Promotoren bestimmt. Diese zeigten verschiedene Sequenzelemente und wichen meist von der für Dikotyle publizierten Konsensussequenz ab. Für die Mehrheit der Gene wurden multiple Promotoren identifiziert. Es wurden weiterhin Promotoren nachgewiesen, welche die Transkription vermutlich nicht funktioneller Sequenzen aktivieren. Architektur, Lokalisation und Nutzung mitochondrialer Promotoren implizieren eine wenig stringente Kontrolle der Transkriptionsinitiation in Arabidopsis-Mitochondrien. Zur Analyse der Funktionen von RpoTm und RpoTmp wurde ein in vitro-Transkriptionssystem entwickelt. Da RpoT-Enzyme möglicherweise Kofaktoren benötigen, wurde in Arabidopsis nach Genen potentieller mitochondrialer Transkriptionsfaktoren gesucht. Als mitochondriales Protein mit Ähnlichkeit zu mtTFB, einem essentiellen Transkriptionsfaktor in Hefemitochondrien, wurde MetA identifiziert. In in vitro-Assays initiierte RpoTm an verschiedenen Promotoren die Transkription, während RpoTmp keine signifikante Promotorspezifität zeigte. Die spezifische Promotornutzung durch RpoTm erforderte superhelikale DNA. Weder RpoTm noch RpoTmp wurde durch MetA stimuliert. Eine mtTFBähnliche Funktion von MetA ist daher unwahrscheinlich. Für MetA wurde ausserdem eine engere phylogenetische Beziehung zu nukleären rRNA-Dimethylasen als zu mtTFB ermittelt. Die hier vorgestellten Studien belegen die Transkription mitochondrialer Gene in Arabidopsis durch RpoTm; für RpoTmp ist eine nicht-redundante Transkriptionsfunktion denkbar. Die Kofaktor-unabhängige Spezifität von RpoTm für verschiedene Promotoren und die wenig stringente Initiationskontrolle in vivo legen nahe, dass eine individuelle Regulation mitochondrialer Gene in Arabidopsis auf Transkriptionsebene nicht erfolgt. Schlagworte: Pflanzenmitochondrien Mitochondriengenom Promotor Transkription Phagentyp-RNA-Polymerasen Abstract Mitochondria depend on a nucleus-encoded transcription machinery to express their genome. The present study examined the transcription of mitochondrial genes by two nucleus-encoded phage-type RNA polymerases, RpoTm and RpoTmp, in the plant Arabidopsis. For selected mitochondrial genes in Arabidopsis, transcription initiation sites were determined. Most genes were found to possess multiple promoters. The identified promoters displayed diverse sequence elements and mostly deviated from a nonanucleotide consensus derived previously for dicot mitochondrial promoters. Several promoters were detected that activate transcription of presumably non-functional sequences. Promoter architecture, distribution and utilization suggest a non-stringent control of transcription initiation in Arabidopsis mitochondria. An in vitro transcription system was set up to elucidate the roles of RpoTm and RpoTmp. Since RpoT enzymes possibly require auxiliary factors, the Arabidopsis genome was screened for potential cofactors of phage-type RNA polymerases. A mitochondrial protein (MetA) with similarity to mtTFB, an essential transcription factor in yeast mitochondria, was identified. In in vitro transcription studies, RpoTm recognized various promoters whereas RpoTmp displayed no significant promoter specificity. Promoter recognition by RpoTm depended on supercoiled DNA templates. Transcription initiation by RpoTm or RpoTmp was not affected by MetA, indicating that MetA is not functionally equivalent to mtTFB. Besides, MetA was found to be more closely related to non-mitochondrial rRNA dimethylases than to mtTFB. The present study establishes RpoTm to transcribe mitochondrial genes; RpoTmp may have a non-overlapping transcriptional role in mitochondria. The cofactor-independent promoter specificity of RpoTm and the apparently non-stringent control of transcription initiation in vivo imply that mitochondrial genes in Arabidopsis may not be regulated individually at the transcriptional level.